A genom tartalmazza egy sejt vagy szervezet felépítésének és működésének örökletes információját. Ez az információ DNS-ben, bázissorrend formájában tárolódik. A DNS viszonylag kis százaléka kódol fehérjéket és ribonukleinsavakat (RNS-eket), míg a genom nagy része funkcióval nem rendelkező szekvenciákból áll. A DNS-ben tárolt információ funkcionális molekulává, azaz RNS-sé és fehérjékké történő átalakítását génexpressziónak nevezzük. A génexpresszió két szakaszban zajlik: átírás (transzkripció) és átfordítás (transzláció). Az átírás során a DNS RNS-sé másolódik. Az RNS-t ezután fehérjék szintetizálására használják az átfordítás során.

Az átírásban kulcsszerepet játszó enzimek a DNS-függő RNS-polimerázok. Ezek az enzimek a DNS-ben kódolt géneken alapulva szintetizálják az RNS-molekulát. A gének tartalmaznak kezdőhelyeket (promótereket), ahol az átírás megkezdődik. A promóter felismeréséhez átírási faktorokra van szükség. Az RNS-polimeráz a kétszálú DNS templát szálán mozog. A szál addig szintetizálódik, amíg el nem éri a DNS-szegmens végét (terminációs hely). Eukariótákban az újonnan képződött elsődleges transzkriptum további módosításokon esik át, hogy például fehérjeszintézisre alkalmas legyen.

A génexpresszió minden szinten szigorúan szabályozott. Néhány gén minden sejtben kifejeződik, és alapszintű sejtműködésekhez (háztartási génekként) szükséges (azaz konstitutív expresszió). Más gének csak bizonyos sejtekben aktívak; expressziójukat számos mechanizmus szabályozza. A géneket aktiválhatják vagy elhallgattathatják, és az átírás specifikus DNS-kötő fehérjék jelenlététől függ. Az újonnan képződött RNS az átírás után különböző mechanizmusokkal lebomlhat, mielőtt a fehérjeszintézisben felhasználnák. Transzlációs szinten is léteznek szabályozó mechanizmusok. Bár egy szervezet minden sejtje ugyanazt a DNS-t tartalmazza, bizonyos gének szabályozott expressziója okozza, hogy a sejtek specializálódnak és különböző funkciókat látnak el, például izomsejtek vagy hepatociták.

Áttekintés

Áttekintés

• Génexpresszió: A DNS-ben tárolt genetikai információ funkcionális géntermékké (RNS-sé és fehérjékké) alakítása,
• Fehérjeszintézis: A génexpresszió folyamata (mely az átírásból és az átfordításból áll), valamint a poszt-transzkripcionális módosítások,
• A molekuláris biológia centrális dogmája: A genetikai információ mindig egy irányba áramlik: DNS-ről RNS-re, RNS-ről pedig fehérjére,
• DNS → (átírás/transzkripció) → RNS → (átfordítás/transzláció) → fehérje,
• Kivétel: A retrovírusok, amelyek képesek DNS-t előállítani RNS-ből, saját enzimjük, a reverz transzkriptáz segítségével (reverz átírás/reverz transzkripció).

A fehérjeszintézis során a DNS-t először mRNS-sé írják át (transzkripció), majd az mRNS-t aminosavlánccá fordítják le (transzláció).

Transzkripció

Az átírás során a DNS templátként szolgál egy komplementer RNS-molekula előállításához. A kétszálú DNS (dsDNS)-ből csak egyetlen szálat olvasnak le.

Áttekintés

• DNS-szegmensek:
• Szenz szál (kódoló szál): A kétszálú DNS azon DNS-szegmense, amely komplementer az antiszensz szállal, és bázissorrendje majdnem azonos az antiszensz szál mentén átíródó mRNS-sel A szenz szál nem vesz részt az átírási folyamatban,
• Antiszensz szál (templát szál): A kétszálú DNS azon DNS-szegmense, amely templátként szolgál az átíráshoz a komplementer mRNS-szál előállításához
• Promóter:
• A promóter egy specifikus DNS-szekvencia, amely egy gén upstream (= 5' régiójában) helyezkedik el, és szabályozza az átírást,
• Jellemzően AT-gazdag szekvenciákat tartalmaz (pl. TATA-box és CAAT-box). Az RNS-polimeráz II és számos más átírási faktor kötőhelyeként szolgál az átírás kezdeténél
• A promóterek helyén bekövetkező mutációk általában az átírási sebesség súlyos csökkenéséhez vezetnek,
• Fontos megjegyezni, hogy a promóterek elsődlegesen az átírási aktivitást szabályozzák, nem pedig a replikációs aktivitást a replikáció origójánál (ori),
• Szubsztrátok: A nukleozid-trifoszfátok ATP, GTP, CTP és UTP,
• Enzimek: RNS-polimerázok,
• Általános transzkripciós faktorok: Specifikus helperfehérjék, amelyek segítik az RNS-polimerázt a promóter megtalálásában és a promóterhez való kötődésben, valamint az RNS-szintézis megindításában

RNS polimerázok és transzkripciós faktorok

RNS polimerázok

Az átírási reakciókat (DNS-függő) RNS-polimerázok katalizálják. Eukarióta sejtekben különböző típusú RNS-polimerázok léteznek, amelyek eltérő promóter típusokat ismernek fel és különböző típusú géneket írnak át. Prokariótákban ezzel szemben csak egyetlen típusú RNS-polimeráz van, amely mindhárom RNS-típust átírja.

• Struktúra: Két nagy alegységből áll, számos polipeptidlánccal,
• Funkció: Új RNS-szál szintézise 5′-3′ irányban; a DNS-szál leolvasása 3′-5′ irányban,
• Feltekercseli a DNS-t más enzim segítsége nélkül (intrinzik helikáz aktivitás),
• Iniciálja az átírást (RNS-polimeráz II kinyitja a DNS-t a promóter régióban),
• Rendelkezik intrinzik hibajavító (proofreading) funkcióval

Az RNS-polimeráz II szinte az összes, fehérjéket kódoló gént átírja.

Az RNS-polimerázokat abban a sorrendben számozzák, ahogyan termékeiket a fehérjeszintézis folyamatában felhasználják! I, II és III → rRNS, mRNS, illetve tRNS.

Prokariótákban ezzel szemben csak egyetlen típusú RNS-polimeráz van, amely mindhárom RNS-típust átírja.

Transzkripciós faktorok

Az RNS-polimerázoknak segítő fehérjékre van szükségük az átírandó gének promóterfelismeréséhez.

• Általános transzkripciós faktorok: lehetővé teszik az RNS-polimeráz kötődését a proximális promóter régiókhoz a kromoszómális DNS specifikus bázisszekvenciákhoz való kötődésével → transzkripció kezdete,
• Specifikus transzkripciós faktorok:
• Szabályozó elemekhez (enhancerekhez, silencerekhez) kötődve modulálják a transzkripciót,
• Példa: Szteroid hormonreceptorok.

DNS-kötő fehérjék

A DNS-hez kötődő fehérjék, mint például az átírási faktorok, specifikus fehérje doméneket, más néven szerkezeti motívumokat igényelnek. Ezek a szerkezeti motívumok általában α-hélixet vagy β-redőt használnak a DNS nagy árkába való kötődéshez. Az átírási faktorok DNS-kötő doménekkel rendelkeznek, melyeken keresztül képesek interakcióba lépni specifikus DNS-szegmensekkel funkciójuk ellátása érdekében. Számos DNS-kötő domén szerkezeti motívumát azonosították. Fontos példák a cinkujjas domének, a leucin cipzárak, az alapvető hélix-hurok-hélix, és a homeobox.

• Cinkujj (Zinc finger):
• Jellemzők: Egy cinkiont két hisztidin és két cisztein aminosav-maradék koordinál,
• DNS-kötés: Több cinkujjas domén gyakran láncszerűen kapcsolódik, és a DNS nagy árkának egy α-hélixéhez kötődik,
• Leucin cipzár:
• Karakterisztika:
• Két hosszú α-hélix, amelyek hidrofób régióikon keresztül kötődnek egymáshoz, és szupertekercset alkotnak,
• Mivel minden hetedik aminosavmaradék leucin, és a maradékok cipzárszerűen összefonódnak, ezt a szerkezeti motívumot leucincipzárnak nevezik,
• DNS-kötés: Az α-hélixek DNS-hez kötődő hidrofíl régiói számos bázikus aminosav-maradékot tartalmaznak, amelyek kölcsönhatásba lépnek a DNS nagy árkával,
• Alapvető hélix-hurok-hélix:
• Karakterisztika:
• Két polipeptidlánc, melyek egy rövid és egy hosszú α-hélixből állnak, és egy rugalmas hurok köti össze őket (ennek nincs másodlagos szerkezete),
• A két polipeptidlánc a két α-hélix bázikus régióin keresztül dimerizálódik
• DNS-kötés: A rövid bázikus α-hélix kölcsönhatásba lép a DNS-sel,
• Homeobox (hélix-forduló-hélix motívummal)
• Jellemzők: Egy polipeptidlánc, amely három rövid, egymást követő α-hélixet tartalmaz, a harmadik α-hélix az első kettőre merőlegesen helyezkedik el egy fordulón keresztül,
• DNS-kötés: A harmadik, viszonylag bázikus α-hélix felismerő hélixként kötődik, különösen a DNS nagy árkában lévő szabadon álló bázisokhoz.

A DNS-kötő fehérjék egyik fontos szerkezeti motívuma a sok bázikus aminosav-maradékot tartalmazó α-hélix.

A transzkripció szakaszai

A transzkripció három fázisra oszlik: Iniciáció, elongáció és termináció.

1. Iniciáció (transzkripció): A transzkripció kezdete az iniciációs komplex kialakulásával és a DNS kitekeredésével,
1. Preiniciációs komplex (RNS-polimeráz-promóter zárt komplex) kialakulása az általános átírási faktorok és az RNS-polimeráz promóter régióhoz (pl. TATA-box, CAAT-box, GC-box) való kötődésével,
2. Transzkripciós buborék képződése a DNS-kettőshélix egyetlen, 10–12 bázis hosszúságú szállá történő feltekercselésével (nyitott komplex),
3. Az RNS-szintézis megkezdése
2. Elongáció:
• Az RNS-szál meghosszabbítása
• A növekvő RNS-szál 3′OH csoportja a következő komplementer nukleozid-trifoszfát α-foszfátcsoportjához kapcsolódik
3. Termináció: A termináció során megkezdődik a poliadeniláció.

Az átírás során bázispárosodás történik a DNS és az RNS között. Az RNS-ben lévő uracil (timin helyett) a DNS-ben lévő adeninnel párosodik.

Az RNS és a DNS antiparalel irányban párosodik. Ez azt jelenti, hogy az egyik szál 5′-vége a másik szál 3′-végéhez kapcsolódik, és fordítva. Mindkét esetben a bázissorrendet a szokásos 5′ → 3′ irányban írjuk.

Poszttranszkripciós módosítás (RNS-feldolgozás)

Eukariótákban az átírás végterméke a heterogén nukleáris RNS (hnRNS), amely a sejtmagban zajló poszttranszkripcionális módosítások révén érett mRNS-sé alakul. Ezek a módosítások magukban foglalják a cappolást (sapka felhelyezését), a poliadenilációt, a splicingot (kivágás és összeillesztés), valamint az RNS-szerkesztést. Az mRNS ezután elhagyja a sejtmagot és belép a citoszolba.

Cappolás (sapkafelhelyezés)

• Definíció: A hnRNS (heterogén nukleáris RNS) 5′-végéhez egy 7-metilguanozin sapka hozzáadása, melynek eredményeként az öt-primer sapka alakul ki,
• Folyamat:
1. Az RNS-trifoszfatáz enzim lehasítja az 5′-foszfát csoportot,
2. A guanililtranszferáz enzim egy GMP-maradékot (mely GTP-ből képződik pirofoszfát lehasadása révén) ad hozzá a hnRNS 5′ difoszfát végéhez,
3. A hnRNS egy, kettő vagy három ribóz-maradékának metilációja S-adenozilmetionin (SAM), mint metilcsoport-donor felhasználásával,
• Funkció:
• Véd a degradációtól (exonukleázokon keresztül ),
• A transzláció megkezdése

Poliadeniláció

• Definíció: Az hnRNS (heterogén nukleáris RNS) 3′-végének kiegészítése egy körülbelül 200 adenozin-monofoszfátból álló farokkal (ún. poliadenilát, vagy egyszerűen poli(A) farok),
• A folyamat:
1. Poliadenilációs jel a hnRNS-en: AAUAAA
2. Poli(A) polimeráz: Ez az enzim felelős az adenozin-monofoszfát egységek hozzáadásáért az hnRNS 3'-végéhez, létrehozva a poli(A) farkat,
• A hasítási helyhez kötődik és egy ∼50–250 nukleotid hosszúságú ATP-függő adenozin-monofoszfátot ad hozzá,
• Nem igényel templátot a poliadenilezéshez,
• Funkció:
• Stabilitás ↑ (véd a korai lebomlástól),
• Elindítja a transzlációt.

Splicing (Szekvencia-kivágás és összeillesztés)

Áttekintés

• Definíció: Az intronok kivágása a hnRNS (heterogén nukleáris RNS) transzkriptumokból, és az exonok közvetlen összekapcsolása,
• Funkció: Az intronok eltávolítása annak érdekében, hogy a keletkező érett mRNS (messenger RNS) kizárólag a releváns genetikai információt tartalmazza exonok formájában.

A folyamat

1. Spliceoszóma képződés az exon-intron határon:
• Komplexum:
• Különböző snRNS-ek, amelyek fehérjékhez kötődve snRNP-ket (kis magi ribonukleoproteineket) alkotnak,
• Kiejtés: "sznörpsz",
• snRNP-k elleni ellenanyagok mutathatók ki SLE-ben (szisztémás lupus erythematosus) (anti-Smith antitestek) és kevert kötőszöveti betegségben (Anti-U1 RNP antitestek),
• A módosítandó hnRNS (heterogén nukleáris RNS),
• Számos egyéb kis fehérje,
• A hnRNS érintett szekvencia szegmensei:
• Exon-intron határok: Az RNS-en specifikus bázissorozatok (konszenzus szekvenciák) jellemzik őket
• 5′-os illesztési hely
• 3′-os illesztési hely
• Branch point (elágazási pont): Az intronon belül elhelyezkedő adenin nukleotid, amelyen egy hurokszerkezet (lásd alább) képződik,
• Pirimidin-gazdag szekvencia: A 3′ illesztési hely előtt található,
• A β-globin gén intronikus splice helyeinél fellépő mutációk hibás splicinghoz vezetnek, ami a béta-thalassemia esetén rendellenes β-globin expresszióját eredményezi,
• Az snRNP-k hibás összeszerelődését okozhatják veleszületett rendellenességek, mint például a spinalis izomatrófia, ahol a csökkent SMN fehérje szintje gátolja az összeszerelődés folyamatát,
2. Az exon-intron határ felnyitása az 5′ splice helyen: Egy ideiglenes lariát-szerkezet jön létre egy 2′ → 5′ foszfodiészter kötéssel, amely összekapcsolja a két összekötendő véget egymás közelében (hurokképződés),
3. Az exon-intron határ megnyitása a 3′-os illesztési helyen
4. Az exonvégek összekapcsolása.

Egy gén exonjai a kódoló szegmensek; az intronokat a splicing során távolítják el a hnRNS-ből.

RNS szerkesztés

• Definíció: Az RNS bázisszekvenciájának megváltoztatása egyes bázisok inszerciójával, deléciójával vagy módosításával (a splicingtól függetlenül),
• Funkció: Lehetőséget biztosít különböző fehérjék előállítására,
• Példák:
• A-tól I-ig történő szerkesztés (A-to-I editing): Az adenozin inozinná deaminálódik, azaz az adenin bázis hipoxantinná alakul át,
• hnRNS-ben fordul elő,
• Enzim: RNS-re ható adenozin-deaminázok (ADAR-ok),
• Példa: A glutamát receptor különböző alegység típusainak A-tól I-ig történő szerkesztése (A-to-I editing) megváltoztathatja azok jellemzőit, ami befolyásolja a glutamát hatását a központi idegrendszerben,
• C-től U-ig történő szerkesztés (C-to-U editing): A citidin uridinné deaminálódik, azaz a citozin bázis uracillá alakul át,
• mRNS-ben fordul elő,
• A C-U szerkesztés tipikus példája,
• Az apolipoprotein B (apoB) mRNS-e az apoB-100 fehérjét kódolja,
• Szerkesztés után az apoB mRNS egy jelentősen kisebb fehérjét, az apoB-48-at kódolja, mivel a citidin uridinné történő deaminációja egy stop kodont generál a citidin-deamináz révén,
• C-től U-ig történő szerkesztés (C-to-U-editing) révén, például az enterociták (bélsejtek) apoB-48-at termelnek, szemben a hepatociták (májsejtek) által termelt apoB-100-zal.

Alternatív splicing

• Definíció: Intronok eltávolítása a hnRNS-ből exonok differenciális összekapcsolásával
• Folyamat: Hasonló a splicinghez, további splicing faktorokkal, amelyek meghatározzák a splicing helyek tartományát,
• Funkció:
• Egyetlen hnRNS (heterogén nukleáris RNS) szekvenciából különböző fehérjék állíthatók elő, ami lehetővé teszi a DNS megnövelt információ-sűrűségét
• Az új fehérjék képződése megkönnyebbül: Gyorsabb alkalmazkodás a megváltozott életkörülményekhez,
• Példák:
• Különböző típusú tropomiozin (izom),
• Dopaminreceptorok (agy),
• Immunoglobulinok (szekretált vs. membranózus).

Az egy gén – egy enzim hipotézis nem érvényes az eukariótákra. Egyetlen génből az alternatív splicing révén különféle fehérjék képződhetnek.

Az mRNS minőségellenőrzése

• Lokalizáció: citoplazmatikus feldolgozó testek (P-testek),
• Exonukleázokat, dekapszulázó enzimeket és mikroRNS-eket tartalmaznak,
• Funkció:
• mRNS lebontása,
• Tárolás későbbi transzlációhoz.

A transzkripció szabályozása

Mivel az átírás (transzkripció) és a fehérjeszintézis nagy mennyiségű energiát igényel, a génexpresszió szigorúan szabályozott. Míg egyes gének folyamatosan átíródnak, más gének szabályozás alatt állnak.

Prokarióta génszabályozás (operon modell)

A génexpresszió szabályozását kezdetben az E. coliban vizsgálták. A bakteriális genomban található szabályozó szekvenciák biztosítják a β-galaktozidáz enzim génexpresszióját, amennyiben a laktóz cukor energiaforrásként elérhető. Emellett más fehérjék is szintetizálódnak, amelyek a laktóz metabolizmushoz kapcsolódnak. Ezért ez több gén koordinált expresszióját foglalja magában.

• Definíció: Modell a prokarióták génszabályozási mechanizmusának leírására,
• Az operon egy prokariótákban található DNS-transzkripciós egység, amely szabályozó elemekből és több, fehérjét kódoló génből áll,
• Eredményeként egy policisztás mRNS képződik,
• Az operon génjei egyetlen mRNS-sé íródnak át,
• Az operon összes fehérjéje az mRNS-t kódolja,
• Funkció: Alkalmazkodás a változó környezeti feltételekhez bizonyos rokon gének expressziójának egyidejű növelésével,
• Példa: A lac operon,
• Leírás: Egy transzkripciós egység, amely a laktóz metabolizmusában részt vevő enzimek génjeit tartalmazza, és csak laktóz jelenlétében fejeződik ki (pl. β-galaktozidáz). A lac operon klasszikus példája annak, hogy a környezet hogyan hoz létre genetikai választ,
• Komponensek (a genomban elfoglalt sorrendjük szerint):
• Regulátor gén (lacI): Bár közvetlenül nem része a lac operonnak, ez a gén egy represszor fehérjét kódol. Ez a fehérje laktóz hiányában az operátorhoz kötődik, megakadályozva a transzkripciót
• Promóter: Itt történik a katabolit aktivátor protein (CAP) és az RNS polimeráz kötődése az átírás során,
• Operátor: A represszor kötőhelye, amely átfedésben van a promóterrel
• lacZ: A β-galaktozidáz génje
• lacY: A permeáz génje
• lacA: A transzacetiláz génje
• Reguláció:
• Glükóz jelenléte és laktóz hiánya → transzkripció nem mehet végbe → a lac represszor kötődik az operátorhoz → polimeráz nem tud kötődni a promóterhez → nagyon kevés β-galaktozidáz molekula van a sejtben,
• Glükóz hiánya és laktóz jelenléte → transzkripció ↑
• Alacsony glükózszint → adenilát-cikláz aktivitás ↑ → cAMP ↑ → CAP (promóter) aktiváció ↑
• A laktóz a lac represszorhoz kötődik → inaktiválódik és disszociál az operátorról → a promóter szabad a polimeráz számára → a β-galaktozidáz molekulák száma a sejtben 1000-szeresére nő,
• Glükóz és laktóz jelenléte: A lac gének nagyon alacsony bazális expressziója.

Eukarióta génszabályozás

A génexpresszió szabályozása az eukariótákban lényegesen bonyolultabb a prokariótákhoz képest. Ennek egyik oka az eukarióta és prokarióta genomok méretbeli különbsége, mivel az eukarióták genomja jelentősen nagyobb. További ok, hogy az eukarióta genomban, a sejtmagban található DNS erősen kondenzált és kromatin formájában csomagolt. Ennek eredményeként kevésbé hozzáférhető, mint a prokarióta DNS. Azonban az eukarióták és prokarióták közös jellemzője az aktivátorok és represszorok fontossága, amelyek specifikus DNS-szekvenciákhoz kötődnek, és növelik vagy gátolják a génexpressziót.

• Disztális szabályozó elemek: DNS-szekvenciák, amelyek befolyásolhatják egy gén átírási sebességét, és elhelyezkedhetnek az általuk szabályozott gén intronja előtt, azon belül vagy után,
• Fokozók:
• Rövid, körülbelül 20 bázispár (bp) hosszúságú DNS-szekvenciák,
• Főként palindromok vagy tandem ismétlődések
• Amikor specifikus transzkripciós faktorok (aktivátorok) kötődnek az enhancer-ekhez, az azonos kromoszómán lévő gén átírási sebessége megnő
• Ezek a transzkripciós faktorok lehetnek ligandum-függőek vagy ligandum-függetlenek,
• Ligandum-függő transzkripciós faktorok: Intracelluláris hormonreceptorok, amelyek a hormonkötést követően a sejtmagban kölcsönhatásba lépnek az enhancer-szekvenciákkal, és növelik a szabályozandó gének átírási sebességét,
• Egy fokozó példái: Hipoxia-válasz elem (HRE),
• A hipoxia-indukálható faktor (HIF) nevű transzkripciós faktor hipoxia (oxigénhiány) során a HRE (Hypoxia Response Element) szekvenciához kötődik, és olyan cél gének expresszióját indukálja, amelyek fontosak a hipoxiás válaszban, például az EPO (eritropoetin) és a VEGF (vaszkuláris endothel növekedési faktor) expresszióját,
• Normoxia (elegendő oxigén) esetén a HIF-et a HIF prolyl hidroxiláz hidroxilálja. A hidroxi-HIF ubiquitilálódik és lebontásra kerül a proteaszómában, így képtelen növelni saját cél génjeinek expresszióját,
• Silencer (Géncsendesítő):
• Specifikus DNS-szekvencia,
• Amikor specifikus transzkripciós faktorok (represszorok) kötődnek a silencerekhez, az azonos kromoszómán lévő gén átírási sebessége csökken.

Transzkripciós inhibitorok

A transzkripciós gátlók erős citotoxinok, de részben antibiotikumként is felhasználhatók.